Nature catalysis综述｜基因编码的非天然氨基酸(ncAAs)在生物催化领域的用途！

▉ 原文信息

今天给大家分享一篇发表在nature catalysis上的综述，作者是Ivana Drienovská 和 Gerard Roelfes。本文介绍了如何利用基因编码ncAAs以提升酶的催化活性的和选择性、催化自然界中不存在的催化反应。

▉ 背景

在过去的二十年间，通过基因编码插入非天然氨基酸（ncAAs）的方法与技术日渐成熟。新的正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的发展已经向遗传密码中添加了很多非天然氨基酸，这些非天然氨基酸有天然的20种氨基酸中不存在的结构和功能，因此为蛋白质功能的增强或产生新的蛋白质特性提供可能。

▉ 内容

▉ 1.基因密码子扩展方法

除了少数的吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸，所有生物的遗传密码都编码相同的20种氨基酸。基因密码子扩展一般有以下两种方法：

（1）selective pressure incorporation (SPI)：

这种方法效率较低，原理是某些tRNA可以装载与cAA（标准氨基酸）结构类似的ncAA，当机体本身没有足够的cAA时（即营养缺陷型），则依赖于外源性的cAA，若内源性和外源性cAA都不存在时，则机体会选择利用其类似物。因此这种方法的优点是只需在操作上选择营养缺陷型菌株即可实现ncAA的插入，思路较为简单，但是此法有较大的局限性——1.可以插入的ncAA仅限于cAA的结构类似物；2.这种方法的结果是全局替换，即完全替换或完全不替换，这可能会带来蛋白质活性和稳定性的下降。

（2）stop codon suppression (SCS)：

此法需要使用正交的翻译系统（即与内源翻译系统无串扰的翻译系统），包括正交的tRNA和正交的氨酰tRNA合成酶（aaRS，正交的aaRS不能识别内源性的tRNA或氨基酸）。正交的aaRS/tRNAd对能够特异识别所需的ncAA（TyrRS/ tRNACUA对和PylRS/tRNACUA对使用最广泛），并能够在特定的位点（使用终止密码子为位点插入，常用UAG）中将其掺入。目前已经有超过200种ncAAs成功利用此法插入蛋白质多肽链中。

▉ 2. 基因编码的ncAAs在生物催化中的作用

（1） 改善天然酶的活性

活性位点结构与催化反应过渡态的互补性是酶能加速反应速率的关键，ncAA可用于微调活性位点中空间和电子的相互作用，从而实现对酶活性的调节。

很多研究都表明，通过SPI法用ncAA全面替代cAA可以改善酶的活性和选择性。例如，早在2001年，有研究小组将限制性核酸内切酶Pvu II的四个苯丙氨酸残基分别用邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸替换，需要注意的是，四个苯丙氨酸残基均不属于该酶的催化中心或DNA的结合位点。研究发现，用邻氟苯丙氨酸和间氟苯丙氨酸替换得到的Pvu II变体显示出与野生型（wild-type）酶相似甚至更低的活性，而用间氟苯丙氨酸替换得到的变体显示出的活性是野生型的两倍。

（2）辅助功能

酶通常包含具有辅助功能的氨基酸，这些辅助功能支持酶的催化作用，如介导电子转移等（例如自然界中酪氨酸具有在酶促反应中同时提供电子和质子的独特能力，某些ncAA也可发挥这些催化作用）。此外，大自然本身可以通过翻译后修饰来调节酪氨酸的性质以优化其催化效率。
例如，半乳糖氧化酶中的酪氨酸-半胱氨酸交联（Tyr-Cys crosslink）是翻译后修饰形成的，这是该酶能将很多醇氧化为醛的关键，通常在其他酶中很难产生这种修饰。但是，我们可以通过ncAA来模拟这种修饰，即模拟酪氨酸-半胱氨酸交联的结构。使用SCS法，用ImiTyr和MtSTyr掺入抹香鲸肌红蛋白的肽链中以分别模拟Tye-His和Tyr-Cys的交联结构，当MtSTyr代替Tyr被插入于抹香鲸肌红蛋白的肽链中时，Mb33MtSTyr催化羟氨还原为氨的反应效率大大提高（如下图所示），这表示用ncAA可以成功模拟自然界存在的翻译后修饰。

除了上述提到的ncAA可以模拟自然的翻译后修饰外，利用ncAA还可以引入一些自然界中不存在的具有其他辅助功能的基团。如下图所示，Wang等研究者将黄色荧光蛋白肽链中的66位酪氨酸替换成侧链带有二苯甲酮基的ncAA（BpA。二苯甲酮是光催化中常用的光敏剂）。在野生型蛋白中，Tyr66通过Gly65-Tyr66-Gly67三肽结构的自催化转化参与了荧光物质的形成过程，BpA66也能以相同的反应机理进行相同的转化过程，从而产生了一种寿命长的具有三重激发态的生色团，其能与还原剂反应形成极低氧化还原电位的超还原自由基。这种人工荧光蛋白与有机镍-吡啶辅助因子相结合可以成为高效的CO₂光还原催化剂，与其他很多的CO₂光还原催化剂相比效率更高。

利用SCS法还能通过掺入ncAA来实现对蛋白质的时间上和空间上的控制。最常用的策略就是掺入可光照脱笼的ncAA，通过光的有无来控制酶的活性——当有光存在时，光诱导去除保护基，从而激活酶。常用的光笼策略是将邻硝基苄基或其衍生物（caging group）连接在催化残基上，当光（UV）照射时会断裂脱去。如下图所示，当无光照射时蛋白质失活，当有光照射时脱去caging group，蛋白质激活。

（3）提供金属结合位点

当20种cAAs无法实现某些特殊的催化活性时，自然界存在的一种方法是募集辅助因子（如金属离子）进行催化。金属离子的催化活性很大程度上取决于其配体。有金属离子结合特性的ncAAs可以使得人工金属酶更有效地结合金属离子以及调节催化特性。如下图上方表示通过插入ncAA于金属酶的肽链中，可以为金属酶提供多一个金属离子结合位点；下图下方表示可以通过插入具有金属结合特性的ncAA于目标蛋白中引入新的金属结合位点。

利用这个特性，Schultz课题组将BpyA插入到大肠杆菌分解代谢激活蛋白中，该蛋白在结合铜离子或铁离子后显示出核酸酶活性。

另一个例子是：LmrR没有自然催化功能，是一个二聚体蛋白，它的二聚体界面上存在疏水性的孔，可以结合各种疏水性有机物（比如药化或抗生素等等），这一特性使得在LmrR引入具有特殊功能的ncAA并提供合适的结合口袋成为可能。Drienovská等研究者在LmrR蛋白的肽链上多个位点掺入ncAA——BpyA（具有铜离子结合位点），所得人工金属酶能催化如下图所示的F-C烷基化反应，其中在89位（LmrR_M89BpyA）掺入可获得最佳的结果，反应催化效率高。与LmrR蛋白类似，具有较大的疏水口袋的类似蛋白如QacR、CgmR和RamR也可作为蛋白质支架，如所得的QacR_Y123BpyA变体的反应催化效率很高。如下图所示：

（4）ncAAs作为催化残基

自然界扩展酶催化范围的一种方法是对氨基酸侧链进行翻译后修饰，以形成具有新功能和活性的非规范残基。而通过上述提到的SCS的办法，也可以将带有非天然侧链反应性基团的ncAAs引入蛋白质中。如下图所示，将含有反应性官能团的ncAA遗传掺入到蛋白质肽链中，能够产生具有新的活性的酶。

将遗传编码的ncAA作为催化残基、形成能催化新反应的人工设计酶的第一个实例是：将对氨基苯丙氨酸（pAF）掺入LmrR中。苯胺侧链在非生物肼和肟的生成反应中具有催化活性。与苯胺催化反应相比，LmrR_V15pAF的变体的催化效率提高约560倍，与同构的LmeR_V15Y相比效率提高11倍。通过几轮的定点饱和突变进一步优化该酶，设计的四个位点突变体LmrR_V15pAF_A11L_N19M_A92R_F93H表现出了更高的催化效率，远远超过苯胺的催化效率。

▉ 小结

上述所提供的例子表明，遗传编码的ncAA已经对生物催化领域产生了相当大的影响。

在酶中插入遗传编码的ncAA的最大的好处在于，可以快速获得具有新型催化活性的酶，然后可以通过生物技术进一步优化，以实现酶的最佳催化活性和选择性。经过多年的发展，使用SCS法插入的ncAA的数量已经大大增加，但仍需要开发出更多的正交翻译系统（OTS，orthogonal translation systems）以掺入更多的含有金属离子配体或含有催化反应基团的侧链的ncAA。部分ncAAs还具有合成困难、合成成本较高等缺点。此外，还需要考虑的是蛋白表达产量，这取决于蛋白质、ncAA插入位点的选择和OTS的效率……尽管该领域还有很多问题亟待解决，但该领域的研究进展非常快，相信包含遗传编码的ncAA的酶将是未来生物催化领域不可或缺的一部分

参考资料:

https://www.nature.com/articles/s41929-019-0410-8

编辑：yyt

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